本发明公开了一种端粒酶活性检测试剂盒及其检测方法，通过三元连接结构探针识别端粒酶产物，并结合三元连接结构触发的DNA分子机器与碱基堆积触发的DNA分子机器实现等温级联核酸扩增，将肿瘤细胞提取物中端粒酶的逆转录事件转化为显著放大的荧光检测信号，从而精确测定痕量肿瘤细胞中端粒酶的活性，并实现对化学药物抑制肿瘤细胞端粒酶活性的检测。