本发明公开了一种人脂肪干细胞的分离培养方法和干细胞库的构建方法，包括以下步骤：（1）采集人脂肪组织；（2）获取和分离人脂肪干细胞；（3）干细胞培养；（4）检测、冻存；（5）建库。本发明采用D-Hanks平衡盐液配制的含有Ⅰ型和Ⅵ型胶原酶的混合胶原酶对脂肪组织进行消化，使得组织消化的更彻底，明显降低杂细胞数量和除去组织块；用含有10-15%胎牛血清、10³-10⁵U/mlLIF的MCDB-201培养液对分离后的干细胞进行培养，细胞增殖快、形态好，能有效抑制干细胞的分化，保证原代干细胞的特性，同时还能促进人脂肪干细胞的长期生长，以及保持自我更新及多向分化潜能等特点；将得到的干细胞建库保存，保证了更为优质的种子细胞来源。