本发明提供了一种牛滋养层干细胞建系方法，其是在体外条件下，将经过链霉蛋白酶处理去透明带后的牛囊胚接种于经丝裂霉素处理后的小鼠胎儿成纤维细胞和Wnt-3A小鼠皮下结缔组织细胞的饲养层中，加入2i小分子抑制剂培养液进行细胞的传代培养，从而构建牛滋养层干细胞系。该法可用于获得和在体外条件下长期培养牛滋养层干细胞。本发明的牛滋养层干细胞建系方法可以在大动物转基因和体细胞克隆中应用，并可进一步用于牛胚胎着床和胎盘分化的研究。