本发明公开了一种筛选乳腺癌干细胞的三维培养方法，采用水凝胶对人乳腺癌细胞进行三维培养，直接获得乳腺癌干细胞微球，所得微球细胞为ESA⁺CD44⁺/CD24^-/low表型，明显具有肿瘤干细胞的特性，该发明方法是可靠的乳腺癌干细胞筛选方法。本发明操作简单，且与流式细胞仪筛选法等现有技术相比，大大降低了试剂耗材、仪器使用和人力资源等方面的成本。