本发明涉及干细胞技术领域，具体涉及一种人跟腱来源肌腱干细胞的冻存液及其制备方法。本所述人跟腱来源肌腱干细胞的冻存液由条件培养液和二甲基亚砜组成。所述人跟腱来源肌腱干细胞的冻存液的制备方法，包括以下步骤：(1)细胞培养；(2)条件培养液的制备；(3)按照9：1的体积比例将条件培养液与二甲基亚砜混合。本发明一方面可以在一定程度上降低细胞冻存的成本，另一方面可以避免异源性物质的引入，与常规细胞冻存液相比具有更高的临床安全性。本发明的人跟腱来源肌腱干细胞的冻存液在细胞冻存过程中对细胞损伤作用较小，细胞活率较高，冻存效果明显优于常规细胞冻存液，可以用于人跟腱来源肌腱干细胞的长期保存及应用。