本发明公开了一种基于干细胞分泌生物活性因子培养基及其制备和使用方法。其制备过程为：收集干细胞培养扩增过程中更换的废弃培养液；将其进行冻融、低温分离、超滤和浓缩，得到富含丰富生物活性因子的溶液；测定浓缩物所含的蛋白浓度，按照一定的比例添加到基础培养基中。通过该方法制备的培养基可用于各种间充质干细胞、人脐静脉内皮细胞、人正常肝细胞等细胞的培养。