本发明公开了一种跟腱来源肌腱干细胞原代分离消化液及分离方法。所述分离消化液为含表面活性剂的酶溶液，所述消化液为含表面活性剂的I型胶原酶溶液。所述分离方法包括用消化液振荡消化跟腱组织，所述消化液为含表面活性剂的酶溶液。本发明在消化硬度较大的组织块时，使用含有表面活性剂的消化液，降低振荡消化过程中细胞受到的剪切力，保证良好的细胞状态；振荡消化可以有效缩短消化时间，仅消化30分钟就可以得到小的跟腱组织块，消化效率高。