本发明公开了一种山药原生质体制备及纯化方法。选取山药幼叶，消毒处理；将叶片切成细条放入酶解液，黑暗条件下酶解去除细胞壁；酶解混合物在水平摇床上处理，充分释放原生质体；然后用尼龙网膜将酶解混合物过滤至离心管，过滤产物离心后弃上清，加入洗涤液，轻缓颠倒使细胞悬浮；离心分离原生质体，去上清，加入原生质体保存液，重新悬浮细胞后静置，使原生质体自然沉降；最后吸取上层细胞悬液，得到纯化的山药原生质体。本发明原材料易得，消毒方法对外植体的损伤较小，消毒效果好，污染率低；针对山药叶片特性优化了酶解体系和条件，获得的原生质体产量大，活性高；采用自然沉降的方法，可减少细胞碎片等杂质，获得较高纯度的原生质体。