本发明提供了尖吻蝮蛇凝血酶的制备方法以及其分离的尖吻蝮蛇凝血酶。所述制备方法依次包括分子筛凝胶层析柱、阴离子交换层析柱和分子筛凝胶层析柱纯化。所得的尖吻蝮蛇凝血酶纯度高，止血效果好。另外，本发明还提供了该尖吻蝮蛇凝血酶的药物组合物及止血用途等。