本发明涉及一种人工模拟骨髓微环境培养骨髓间充质干细胞的方法，包括以下步骤：获取骨髓间充质干细胞，采用三维细胞培养支架于培养基中进行体外培养；其中，所述三维细胞培养支架是由胶原支架、纳米晶胶原基骨和脱细胞软骨三者中的至少两种组合制成的。采用两种及以上的三维细胞培养支架以人工模拟骨髓微环境进行培养骨髓间充质干细胞的方法，避免了单一的三维细胞培养支架生物相容性较低、细胞黏附性能弱等问题，从而可真正实现骨髓间充质干细胞的三维培养，不仅能够提高骨髓间充质干细胞的活性，而且还能够提高骨髓间充质干细胞的扩增率。