本发明公开一种检测日本乙型脑炎病毒的RT-LAMP核酸试纸条试剂盒及应用。该试剂盒包含核苷酸序列如SEQ ID NO.1～6所示的引物组和核酸检测试纸条。该试剂盒的使用方法如下：配制RT-LAMP反应体系，进行恒温反应；恒温反应所得产物用核酸检测试纸条检测后直接进行判读：阳性结果为出现两条红色条带，一条位于检测区内，另一条位于质控区内。该试剂盒操作简单、成本低廉，反应结果易于观察，特异性好，非常适用于出口检疫、食品卫生以及畜牧养殖场的现场检测，易于大范围推广应用。