本发明涉及一种利用RNAi技术培育抗TYLCV番茄的方法，属于生物技术领域。该方法将TYLCV的V2和C1基因中的保守序列嵌合并构建反向重复序列的RNAi载体，通过农杆菌介导转化法转化番茄无菌苗子叶或下胚轴外植体，转基因番茄经TYLCV的农杆菌侵染性克隆注射接种和携带TYLCV的烟粉虱接种病毒后都表现对TYLCV抗性，未观察到明显的发病症状。本发明利用RNAi技术可以培育抗TYLCV番茄转基因株系，为防治TYLCV提供了技术支持。