本发明属于软骨组织工程领域。本发明公开了一种基于细胞外基质源性软骨微组织构建的组织工程软骨复合支架及其制备方法。具体而言，通过对新鲜软骨进行湿法粉碎、过筛、脱细胞等工艺，制备软骨细胞外基质源性微载体，可作为种子细胞扩增载体。生物反应器下，此微载体快速扩增软骨细胞并维持其表型，同时也可以促进干细胞向软骨方向诱导分化，并形成软骨微组织。将软骨微组织填充于具有良好力学性能的三维多孔支架的孔隙中，构建成本发明所述的组织工程软骨复合支架。这种复合支架具有良好的力学性能、富含天然软骨细胞外基质成分、为种子细胞的生长提供了良好的微环境、有利于干细胞向软骨方向诱导分化，并有望加速组织工程软骨的体内构建速度。