本发明提供胆固醇修饰的生物可降解聚阳离子载体及制备方法和用途。该载体材料由平均分子量2kD-20kD的功能化线性聚（酰胺-胺）与胆固醇通过酰胺键或酯键连接形成功能化线性聚（酰胺-胺）-胆固醇梳状嫁接物，可在水相介质中自组装形成纳米颗粒，粒径介于20-200nm，纳米颗粒表面带正电荷，胆固醇接枝率为1％-90％。本发明制备的阳离子聚合物纳米颗粒毒性低，具有快速透过细胞膜、易于溶酶体内降解和逃逸的功能，可作为基因转染试剂。且可利用该纳米颗粒载体结构中疏水区携载脂溶性化学药物，利用正电荷特性携载治疗DNA、RNA等基因药物或多肽蛋白药物。