本发明公开了一种诱导人iPSc源性的3D视网膜定向分化为视网膜神经节细胞的方法。它是将人iPSc源性的3D视网膜的神经纤维层消化为单细胞，以该单细胞作为种子细胞接入诱导分化培养基中进行培养，种子细胞分化成视网膜神经节细胞，所述的诱导分化培养基为含有神经营养因子和维持浓度的视网膜分化营养液组成的培养基。本发明从干细胞诱导分化的角度提供了获得一种功能性RGCs新的研究途径，为人iPSc-RGCs的定向分化提供了一种新的研究思路，为探讨人iPSc-RGCs的调控机制提供了新的研究线索，为神经组织工程的研究提供了一种新的种子细胞，并为干细胞移植治疗视觉损伤奠定了理论和实验基础。