本发明公开了一种以愈伤组织为外植体的杂交杨农杆菌转化方法，包括下述步骤：（1）愈伤诱导；（2）愈伤组织预培养；（3）菌种活化与培养；（4）侵染；（5）共培养；（6）延迟选择；（7）诱导不定芽；（8）伸长培养；（9）诱导生根及检测，验证农杆菌基因转化了的杂交杨树。本发明的方法克服了现有技术因以杨树茎段或叶柄为外植体的杂交杨农杆菌转化方法后期染菌而被迫不断继代的缺点，可以用少量愈伤组织外植体快速获得的抗性转基因杨树，周期短、染菌率低、转化效率高，为大规模的转基因杨树提供了一种技术手段。